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IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟及處理方法

更新時(shí)間:2021-09-07      點(diǎn)擊次數(shù):2368
   培養(yǎng)步驟:
  1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中),培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
  2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
  1、對(duì)于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
  1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
  2. 加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。
  3.輕輕吹打細(xì)胞,*脫落后吸出,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
  4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液,將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
  PS:若客戶收到2ml小管細(xì)胞,收到細(xì)胞后,用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi),嚴(yán)格無(wú)菌操作;將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻,放入培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度:若密度未超過(guò)80%,換液繼續(xù)培養(yǎng),視情況傳代或者凍存。若密度超過(guò)80%,可直接進(jìn)行傳代(方法同上)。
  2、對(duì)于懸浮細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
  方法一:收集細(xì)胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
  方法二:可選擇半數(shù)換液方式,棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起,將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
  3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,進(jìn)行離心收集,1000RPM條件下離心8-10分鐘,去除上清,按凍存數(shù)量加入血清及DMSO,凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
  PS:若客戶收到2ml小管細(xì)胞,收到細(xì)胞后,用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi),嚴(yán)格無(wú)菌操作;將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻,放入培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度:若密度未超過(guò)80%,換液繼續(xù)培養(yǎng),視情況傳代或者凍存。若密度超過(guò)80%,可直接進(jìn)行傳代(方法同上)。
  處理方法:
  1. 收到細(xì)胞先不開(kāi)瓶蓋,瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置若干小時(shí)(視細(xì)胞密度而定)穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片,觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài),100×,200×各一張),觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行售后的依據(jù)。
  2. 收到細(xì)胞未開(kāi)封,出現(xiàn)污染狀況我們負(fù)責(zé)免費(fèi)重發(fā)一次細(xì)胞。
  3. 由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩氐挠绊?,故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài),故客戶需要售后是需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后與客服人員溝通的時(shí)間證明,期間間隔時(shí)間不能大于7天。
  4. 如客戶對(duì)細(xì)胞的種類、純度、活性等特性有疑問(wèn),需提供相應(yīng)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果作為依據(jù)。
  備注:各位老師收到后用無(wú)菌離心管收集瓶中培養(yǎng)基,留作過(guò)渡培養(yǎng)
        以上僅供參考,希望對(duì)您有所幫助!
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